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Vol. 27. Issue S1.
XXIII Congresso Brasileiro de Infectologia
(October 2023)
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XXIII Congresso Brasileiro de Infectologia
(October 2023)
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GENES DE REFERÊNCIA PARA ESTUDOS DE EXPRESSÃO RELATIVA POR QPCR EM ISOLADOS DE KLEBSIELLA PNEUMONIAE
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Michelly Maria Pereira e Oliveiraa,
Corresponding author
michelly.poliveira@upe.br

Corresponding author.
, Ana Paula Domingues de Limaa, Paula Mariana Salgueiro de Souzaa, Márcia Maria Camargo de Moraisa, Anna Carolina Soares Almeidab
a Universidade de Pernambuco (UPE), Recife, PE, Brasil
b Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE), Recife, PE, Brasil
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Vol. 27. Issue S1

XXIII Congresso Brasileiro de Infectologia

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Introdução/Objetivo

Isolados de Klebsiella pneumoniae resistentes à multiplas drogas têm sido extensivamente reportados em todo o mundo. Alguns determinantes de resistência tornaram-se mais preocupantes pela sua disseminação, como o gene blakpc, já reportado em cepas com altos níveis de resistência aos carbapenêmicos. Em determinados contextos, esse fenômeno é atribuído a mecanismos adicionais, como por exemplo, a regulação da expressão desse gene. Esse trabalho avaliou a estabilidade da expressão de genes candidatos a controles endógenos em K. pneumoniae para aplicação em estudos de expressão relativa por qPCR.

Métodos

Foram pré-selecionados vinte e um pares de iniciadores candidatos a controles endógenos, submetidos a análises in sílico, avaliando-se: amplificação nos principais grupos clonais de K. pneumoniae; tamanho do fragmento; temperatura de melting e formação de estruturas secundárias. Os primers foram validados pelo método de curva padrão. O RNA foi extraído usando TRIzol® e o cDNA, sintetizado com o Kit EasyScript™. As reações de qPCR foram realizadas no equipamento StepOneTM, com o fluoróforo SYBR® Green. Foram utilizados isolados clínicos com distintos perfis de susceptibilidade aos carbapenêmicos para testar a estabilidade dos genes frente a exposição com antimicrobiano. Os dados foram analisados no software BestKeeper.

Resultados

Os primers para os genes proC, rpoC, rho, tuf e rpoB foram validados. Após análises no BestKeeper, os genes rpoC, rpoB, proC e rho, foram categorizados como os mais estáveis. A expressão relativa do gene blaKPC, normalizada com os distintos controles endógenos, mostrou resultados semelhantes, indicando que os genes selecionados são bons normalizadores para estudos de expressão. O isolado com maior concentração inibitória mínima (CIM) para os carbapenêmicos, apresentou maiores níveis de expressão quando comparado ao isolado com menor CIM, utilizando os genes rpoC, rpoB e proC como controles endógenos.

Conclusão

Evidencia-se a importância de avaliar criteriosamente os primers descritos na literatura como etapa anterior às análises de expressão relativa, pois a estabilidade dos genes está associada a condição imposta nas análises e pode gerar resultados não-válidos, além de equívocos de entendimento dos fenótipos. Estudos de estabilidade dos genes de controles endógenos em distintas condições são de suma importância para a confiabilidade dos resultados de qPCR.

Palavras-chave:
qPCR Controles endógenos Resistência bacteriana a antibióticos
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